INSTYTUT DENDROLOGII

Dyrektor i Rada Naukowa Instytutu Dendrologii Polskiej Akademii Nauk uprzejmie zawiadamiają, że dnia 22 marca 2016 r. o godzinie 9 w sali konferencyjnej Hotelu Daglezja Kórnik ul. Woźniaka 7; Kórnik odbędzie się publiczna obrona rozprawy doktorskiej mgr Aleksandry Staszak nt.: „Rola wybranych białek w nabywaniu i ustępowaniu głębokiego spoczynku fizjologicznego nasion Acer platanoides L. i Fagus sylvatica L.”
Promotor:
dr hab. Tomasz Pawłowski, prof. nadzw. ID PAN; Instytut Dendrologii Polskiej Akademii Nauk; Kórnik
Recenzenci:
Prof. dr hab. Monika Kozłowska; Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu
Prof. dr hab. Franciszek Dubert; Instytut Fizjologii Roślin im. Franciszka Górskiego Polskiej Akademii Nauk; Kraków

Praca doktorska znajduje się do wglądu w Bibliotece Instytutu Dendrologii PAN, ul. Parkowa 5; Kórnik

Prezentujemy streszczenie oraz recenzje pracy doktorskiej.

Nasiona wielu gatunków drzew leśnych klimatu umiarkowanego po osiągnięciu dojrzałości znajduje się w stanie spoczynku. U klonu zwyczajnego (Acer platanoides L., kategoria orthodox) i buka zwyczajnego (Fagus sylvatica L., kategoria intermediate) nasiona charakteryzują się głębokim spoczynkiem fizjologicznym ulokowanym w dojrzałych zarodkach. Spoczynek ustępuje w wyniku wielotygodniowego przechowywania uwodnionych nasion w temperaturze 3°C. Ustępowanie spoczynku powiązane jest z działalnością wielu szlaków metabolicznych, a blokada któregoś z procesów wiąże się z pozostaniem nasion w stanie spoczynku. Mechanizm regulujący spoczynek składa się z wielu zależnych od siebie elementów, m.in. jest wynikiem antagonistycznego działania kwasu abscysynowego (inhibitor kiełkowania) i giberelin (promotory kiełkowania). Mechanizm związany z nabywaniem i ustępowaniem spoczynku pozostaje wciąż nie w pełni zrozumiany. Niniejsza praca ma na celu przyczynienie się do lepszego zrozumienia mechanizmu regulującego spoczynek (nabywanie i ustępowanie) u nasion roślin wieloletnich charakteryzujących się głębokim spoczynkiem fizjologicznym.

Wykorzystując narzędzia biologii molekularnej: (1) proteomiki w celu poznania białek związanych z nabywaniem spoczynku, (2) immunodetekcji Western blotting w celu zanalizowania białek ABI5, 14-3-3 (białka szlaku przekazywania sygnału kwasu abscysynowego) i RGL2 (białko szlaku przekazywania sygnału kwasu giberelinowego), (3) qRT-PCR w celu analizy poziomu transkryptów genów ABI5 i 14-3-3, mikroskopię konfokalną w celu prześledzenia zmian lokalizacji badanych białek (ABI5 i RGL2), a także cytometrię przepływową dla określenia aktywności cyklu komórkowego w komórkach rozwijającego się zarodka, określono scenariusz zmian związanych z regulacją procesu spoczynku zarówno podczas jego nabywania jak i ustępowania.

W wyniku dokonanych analiz stwierdzono, że w proces morfogenezy i dojrzewania nasion klonu zaangażowane są białka związane z przetwarzaniem informacji genetycznej (białko bogate w glicynę wiążące RNA i białka proteasomu), metabolizmem metioniny (reduktaza sulfotlenku metioniny), oraz procesami komórkowymi (a-tubulina) i antyoksydacyjnymi (peroksydaza askorbinianowa). Podczas rozwoju nasion klonu zwyczajnego stwierdzono wzrost aktywności cyklu komórkowego. W 17 tygodniu po kwitnieniu zakończył się etap morfogenezy zarodka. Rozpoczął się natomiast etap dojrzewania zarodka, w którym nasiona wchodzą w stan spoczynku. Komórki zarodka w końcowej fazie dojrzewania zawierają dużą liczbę jąder z 4C DNA, co wiąże się prawdopodobnie z niezakończonym etapem dojrzewania nasion oraz z gotowością zarodka do podjęcia aktywności po ustąpieniu spoczynku. Podczas końcowej fazy dojrzewania stwierdzono akumulację białek ABI5 oraz RGL2, co wskazuje na ich udział w nabywaniu spoczynku nasion.

Ustępowanie spoczynku w wyniku chłodnej stratyfikacji powiązane jest ze zmianami w szlakach przekazywania sygnału hormonów, kwasów abscysynowego oraz giberelinowego, powodując kiełkowanie nasion. Białka ABI5 i 14-3-3 są regulowane przez chłodną stratyfikację, która obniża ich ilość i znosi działanie kwasu abscysynowego. Analiza transkrypcji (qRT-PCR) wykazała, iż poziom mRNA dla ABI5 podczas stratyfikacji zmniejsza się szybciej niż poziom białka. Białko RGL2 hamuje przekazywanie sygnału kwasu giberelinowego. Chłodna stratyfikacji obniża jego ilość umożliwiając kiełkowanie.

W kolejnych tygodniach stratyfikacji nasion stwierdzono trojakiego rodzaju zmiany w immunolokalizacji białek ABI5 i RGL2: tkankowe, komórkowe i organellowe. W trakcie stratyfikacji lokalizacja białek zmieniała się z merystemu wierzchołkowego do kory pierwotnej. Akumulacja białek ABI5 i RGL2 w merystemie wierzchołkowym w pierwszych tygodniach stratyfikacji jest związana prawdopodobnie z utrzymywaniem spoczynku. RGL2 stwierdzono w jąderkach na początku stratyfikacji, co świadczy o intensywnej aktywności transkrypcyjnej w tym okresie, związanej z utrzymywaniem spoczynku. Uzyskane wyniki wskazują na różnice w regulacji spoczynku u badanych gatunków, na co znaczący wpływ może mieć przynależność obu gatunków do dwóch kategorii, związanych z tolerancją na podsuszanie i przechowywanie, orthodox i intermediate.

The role of selected proteins in the acquisition and breaking of deep physiological dormancy in seeds of Acer platanoides L. and Fagus sylvatica L.

Seeds of many forest tree species in temperate climate are characterized by dormancy. Norway maple (Acer platanoides L.) and European beech (Fagus sylvatica L.) seeds have deep physiological dormancy, located in mature embryos. It is an internal mechanism that protects seeds against germination in unfavourable conditions for subsequent growth and development of seedlings. Seed dormancy could be broken by stratification of hydrated seeds for several weeks in 3°C temperature. Dormancy status is regulated by a variety of factors, e.g. antagonistic activity of abscisic acid (inhibitor of germination) and gibberellins (promotors of germination), according to the hormone imbalance theory. However, the mechanisms associated with the acquisition and status of dormancy are still not fully understood. This study aims to contribute to better understanding of the mechanisms that regulate dormancy acquisition and braking in seeds of long-lived trees with deep physiological dormancy.

Different approaches were used to estimate the changes associated with the regulation of dormancy acquisition and breaking: (1) proteomics, (2) protein immunodetection, (3) transcriptomics, (4) protein immunolocalization and (5) flow cytometry.

Results of this study indicate that different proteins were associated with embryo development during morphogenesis and maturation. Proteins associated with processing of genetic information (glycine-rich protein and proteosomal protein), metabolism of methionine (reductase of methionine sulfoxide), cell processes (a-tubulin) and defence (ascorbate peroxidase) were differentially abundant during those phases. In the 17th week after flowering the phase of embryo maturation began, during  which seeds enter dormancy. At the end of embryo maturation phase the proteins such as ABI5 (associated with abscisic acid pathway) and RGL2 (gibberellins pathway) were accumulated, which suggests their participation in dormancy acquisition. Moreover, Norway maple embryos in the last phase of maturation contained large numbers of nuclei with 4C DNA. This is probably connected with embryo readiness to start activity after dormancy breaking.

Dormancy breaking during cold stratification is associated with changes in hormonal signalling pathways of abscisic acid and gibberellins that cause germination of seeds. The ABI5 and 14-3-3 proteins are regulated by the cold stratification, which reduces their levels and stops inhibitory influence of abscisic acid. Analysis of transcription (Real-Time-PCR) of mRNA of ABI5 and 14-3-3 proteins during stratification showed that the transcripts’ level decreased faster than proteins’ level. The cold stratification reduced the amount of repressor protein – RGL2, and thus allowed seed germination.

The ABI5 and RGL2 proteins changed the localization in the embryo during seed stratification. Changes were noted on the tissue, cell and organelle levels. Location of the proteins changed from the apical meristem to cortex. The accumulation of ABI5 and RGL2 proteins in the apical meristem in the first weeks of stratification is probably associated with maintaining the dormancy. The RGL2 was found in nucleoli at the beginning of stratification, what reflects the intense transcriptional activity in this period, related to the maintenance of dormancy. The results indicate the differences in regulating the dormancy of the examined species. That likely results from two species belonging to different seed categories associated with tolerance to desiccation and storage – orthodox (tolerant, Norway maple) and intermediate (sensitive, beech).

This work confirmed the hormonal theory of dormancy, which states that dormancy is regulated by the imbalance between inhibitors and promotors of germination. It was also showed that 17 week after flowering is a crucial moment for seed to acquisition of the dormancy. The results showed differences in the depth of dormancy between the two species, which resulted probably from differences in seed desiccation tolerance.

Recenzja 1

Recenzja 2