INSTYTUT DENDROLOGII

Ocena możliwości zachowania zasobów genowych najstarszych dębów (Quercus robur L.) w Polsce przez klonowanie in vitro oraz kriokonserwację

Dąb szypułkowy jest jednym z najcenniejszych gatunków lasotwórczych w Polsce o dużym znaczeniu ekonomicznym. Występuje on w naturalnych skupiskach -dąbrowach lub z innymi gatunkami w borach mieszanych. W ostatnich latach obserwuje się coraz powszechniej występujące zjawisko zamierania drzewostanów dębowych, a trudne warunki siedliskowe nie sprzyjają naturalnym odnowieniom. Problem ten dotyka również najstarszych dębów, mających najczęściej status drzew pomnikowych, których wiek sięga kilkuset lat. W takiej sytuacji kluczowe jest zachowanie zasobów genowych, szczególnie w przypadku wiekowych drzew, które obok znaczenia kulturowego posiadają wiele cennych cech odporności na zmieniające się czynniki środowiskowe, ukształtowane na przestrzeni setek lat. Dlatego podjęto badania będące przedmiotem niniejszej rozprawy doktorskiej, dotyczące zachowania zasobów genowych najstarszych dębów w Polsce. Metoda wegetatywnego rozmnożenia dębów tradycyjnymi technikami nie jest możliwa, ponieważ pędy dębów w przeciwieństwie do pędów szybko rosnących drzew takich jak na przykład gatunki topól czy wierzb nie ukorzeniają się poprzez zrzezy czy odkłady. Dodatkowo proces ukorzeniania się pędów jest szczególnie nieskuteczny w przypadku wiekowych dębów, dlatego niezbędne było sięgnięcie po techniki kultur tkankowych.

Głównym celem rozprawy doktorskiej było określenie potencjału najstarszych dębów rosnących w Polsce do regeneracji i hodowli w warunkach in vitro oraz poszukiwanie technik umożliwiających przechowanie tych cennych zasobów genowych w warunkach kriogenicznych w bankach genów. W pracy doktorskiej materiał roślinny pobierano z drzew czterech przedziałów wieku w zakresie 15-250 lat oraz wybranych 21 dębów pomnikowych z 9 województw (300-800 lat), takich jak na przykład: Dąb Bartek, Dąb Bażyńskiego, Dęby Bąkowskie, Dąb Bolesław, Dąb Bolko, Dąb Chrobry, Dąb Chrześcijanin, Dąb Dziadziuś, Dąb Edward, Dąb Hoggo, Dąb Jan Kazimierz, Dąb Lech, Dąb Mieszko I, Dąb z Owińsk, Dąb Poganin, Dąb Rus, Dąb prof. Władysława Szafera, Dąb Uparty Mazur, Dąb Warcisław oraz Dąb Wybickiego. Zdrewniałe pędy pobrane z drzew pod koniec kwietnia posłużyły do założenia hodowli wazonowej, dzięki której pozyskano pędy odroślowe, a z nich eksplantaty do inicjacji kultur tkankowych. Podczas hodowli in vitro namnażano pędy, po czym je ukorzeniano na odpowiednich pożywkach agarowych. Przedmiotem badań była także indukcja wzrostu tkanki embriogennej z pąków oraz liści przy wykorzystaniu pożywek WPM oraz MS, wzbogaconych o hydrolizat kazeiny oraz regulatory wzrostu NAA oraz BAP. Analizowano również poziom całkowitego zmetylowania cytozyny w genomowym DNA pędów odroślowych w odniesieniu do wieku drzew oraz regeneracji pędów w kulturach in vitro. Ponadto przeprowadzono doświadczenia mające na celu określenie możliwości kriokonserwacji pąków śpiących zlokalizowanych na zdrewniałych pędach oraz pąków bocznych pochodzących z kultur in vitro.

W wyniku inicjacji hodowli in vitro, odkażając eksplantaty w 0,1% roztworze chlorku rtęci przez 3 minuty, utworzono sterylne kultury ulistnionych pędów z 20 spośród 21 badanych drzew pomnikowych. W tracie prowadzenia hodowli obserwowano dla niektórych osobników zamieranie materiału, które nie było skorelowane ani z wiekiem, ani z obwodem drzew, a było związane z genotypem drzew matecznych. W wyniku zastosowanej procedury ukorzeniania uzyskano mikrosadzonki następujących dębów pomnikowych: Dębu Bąkowskiego 2, Dębu Bolesław, Dębu Chrobry, Dębu Dziadziuś, Dębu Rus, Dębu prof. Władysława Szafera oraz Dębu Wybickiego. Określono także efektywną metodę aklimatyzacji roślin uzyskanych w hodowli in vitro do warunków ex vitro z przełamaniem spoczynku pąków jaki nabywały podczas hodowli in vitro. W efekcie uzyskano prawidłowo rosnące sadzonki (klony) w warunkach ex vitro dla takich dębów pomnikowych jak Dąb Bąkowski 2, Dąb Bolesław, Dąb Chrobry, Dąb Rus oraz Dąb Wybickiego. Zastosowanie metody indukcji somatycznej embriogenezy na pożywkach WPM lub MS z dodatkiem hydrolizatu kazeiny oraz regulatorów BAP i NAA pozwoliły na uzyskanie niewielkich ilości tkanki embriogennej zarówno z liści jak i pąków pozyskanych z hodowli in vitro drzew pomnikowych. Doświadczenia nad kriokonserwacją pąków śpiących zlokalizowanych na zdrewniałych pędach nie zakończyły się powodzeniem. Natomiast w przypadku zamrażania stożków wzrostu, izolowanych z pędów hodowanych w kulturach in vitro, dzięki zastosowani krioprotekcji w roztworze PVS2 przez 20 minut, uzyskano ich przeżywalność po rozmrożeniu z LN na poziomie 60%. Badając zależności pomiędzy parametrami wzrostowymi pędów odroślowych w hodowli wazonowej znaleziono korelację średniej i sumarycznej ilości pędów odroślowych z wiekiem drzew matecznych oraz średniej i sumarycznej długości tych pędów z obwodem pnia tych drzew. Natomiast nie zaobserwowano istotnych zależności przybliżonego wieku drzew, ich obwodu ze zdolnością do ukorzeniania się pędów w hodowli in vitro oraz aklimatyzacją mikrosadzonek. Stwierdzono korelację przeżywalność i eksplantatów w początkowym etapie hodowli in vitro i poziomem całkowitego zmetylowania cytozyny w ich genomowym DNA. Natomiast nie znaleziono istotnych zależności pomiędzy przybliżonym wiekem drzew matecznych a poziomem metylo-5-cytozyny w pędach uzyskanych w hodowli wazonowej. Ponadto stwierdzono, że hodowla in vitro nie wpływała na stabilność genetyczną pędów weryfikowaną w 5 loci mikrosatelitarnych.

Wyniki przedstawione w niniejszej rozprawie doktorskiej dostarczają nową wiedzę dotyczącą technik klonowania najstarszych dębów (Quercus robur L.) w Polsce i zmian jakie zachodzą podczas tego zabiegu w tkankach pędów na poziomie genetycznym i epigenetycznym. Badania nad kriokonserwacją poszerzają wiedzę na temat wrażliwości różnych tkanek dębu szypułkowego na ultra niskie temperatury. Nowa metodyka zaprezentowana w pracy znaleźć może szerokie zastosowanie w rozmnażaniu wegetatywnym drzew pomnikowych, drzew doborowych dębu szypułkowego oraz w zachowaniu zasobów genowych cennych, najstarszych osobników tego gatunku rosnących na terenie Polski.