Biochemiczna i biofizyczna charakterystyka osi zarodkowych nasion drzew z rodzaju Acer w warunkach kriokonserwacji

Metodą pozwalającą na wieloletnie przechowywanie materiału roślinnego jest krioprezerwacja, która polega na zamrożeniu w temperaturze ciekłego azotu -196˚C (LN). Celem przeprowadzonych badań było określenie wpływu krioprezerwacji na przeżywalność, stan błon cytoplazmatycznych oraz na stres oksydacyjny w osiach zarodkowych wyizolowanych z nasion z kategorii orthodox: klonu zwyczajnego (Acer platanoides L.) i nasion z kategorii recalcitrant: klonu jawora (Acer pseudoplatanus L.). Nasiona orthodox tolerują desykację oraz niską temperaturę, natomiast recalcitrant są wrażliwe na oba te czynniki. Osie zarodkowe poddano krioprezerwacji w trzech etapach: (i) szybkiej dehydratacji w temperaturze pokojowej, (ii) wolnemu zamrożeniu do temperatury -40˚C ze spadkiem temperatury 0,25˚C min^-1, (iii) gwałtownemu zamrożeniu tkanek w ciekłym azocie przy spadku temperatury 600°C min^-1 na okres 24 h, a następnie rozmrożenie przy wzroście temperatury 370˚C min^-1. Po krioprezerwacji wzrost i rozwój osi zarodkowych klonów oznaczono podczas kultury in vitro na pożywce agarowej.

W niniejszej pracy przy pomocy różnicowej analizy termicznej wykazano, że temperatura krystalizacji wody wolnej w osiach zarodkowych obniżała się wraz ze spadkiem zawartości wody. Brak krystalizacji wody niszczącej struktury błon cytoplazmatycznych wykazano u A. platanoides przy obniżeniu zawartości wody poniżej 26,8%, natomiast u A. pseudoplatanus poniżej 35,8%.

Osie zarodkowe i zarodki zygotyczne A. platanoides wykazują się podobną tolerancją na odwodnienie, mogą być podsuszone do 5% zawartości wody bez utraty przeżywalności. W przypadku A. pseudoplatanus osie zarodkowe znoszą utratę wody do 10% i są bardziej tolerancyjne na odwodnienie w porównaniu do zarodków zygotycznych. Krioprezerwacja w LN osi zarodkowych dawała najwyższą przeżywalność i pozwoliła na osiągnięcie największej ilości wyhodowanych w kulturach in vitro roślin o prawidłowej morfologii dla A. platanoides przy odwodnieniu do 15-10%, natomiast dla A. pseudoplatanus przy 20-15%. Okres kilku mies. krioprezerwacji osi zarodkowych w LN nie miał wpływu na poziom przeżywalności w kulturze in vitro w porównaniu z 24 h przechowywaniem. Osie zarodkowe zachowujące wysoki wigor po krioprezerwacji wykazywały się również brakiem letalnych uszkodzeń błon cytoplazmatycznych. W osiach zarodkowych A. platanoides błony cytoplazmatyczne zachowały stabilność w trakcie krioprezerwacji przy dehydratacji poniżej 20%, ze względu na utrzymanie w nienaruszonym stanie dwóch podstawowych fosfolipidów: fosfatydylocholiny oraz fosfatydyloetanolaminy. Natomiast u A. pseudoplatanus utracie selektywnej przepuszczalności błon dla elektrolitów w trakcie krioprezerwacji towarzyszyła zwiększona deestryfikacja fosfolipidów błonowych oraz peroksydacja nienasyconych kwasów tłuszczowych fosfolipidów w porównaniu do A. platanoides.

Dehydratacja a następnie zamrożenie i przechowywanie w LN osi zarodkowych obu gatunków klonów powoduje w nich stres oksydacyjny, co przejawia się wzrostem zawartości reaktywnych form tlenu (RFT) takich jak: nadtlenek wodoru (H₂O₂) oraz anionorodnik ponadtlenkowy (O₂^•-). W usuwanie RFT są zaangażowane antyoksydanty drobnocząsteczkowe, takie jak: askorbinian (AsA), glutation i α-tokoferol oraz enzymy antyoksydacyjne: dysmutaza ponadtlenkowa (SOD), peroksydaza gwajakolowa (POX) i katalaza (CAT). Najsilniej zaangażowanym antyoksydantem w ochronę komórkową u obu analizowanych gatunków był glutation, którego zawartość ulegała silnemu spadkowi po zamrożeniu do temperatury -40°C oraz po przechowywaniu w LN przy jednoczesnym obniżaniu się przeżywalności osi zarodkowych. Natomiast poziom α-tokoferolu oraz aktywność enzymów antyoksydacyjnych: POX oraz SOD obniżyły się o około 36% przy maksymalnym stresie odwodnienia do 10% i krioprezerwacji u obu analizowanych gatunków w porównaniu do próbek kontrolnych. W przypadku AsA u obu analizowanych gatunków oraz aktywności CAT u A. platanoides, ich poziom podczas krioprezerwacji nie uległ zmianom w porównaniu do tkanek kontrolnych.

Najbardziej niebezpiecznym momentem krioprezerwacji dla osi zarodkowych klonów> jest pierwszy etap przygotowania tkanek, tj. dehydratacja, gdzie może dojść do wzrostu zawartości RFT i naruszenia fizycznej struktury błon cytoplazmatycznych. Osie zarodkowe A. platanoides wykazywały się większą tolerancją w porównaniu do tkanek A. pseudoplatanus oraz lepszymi zdolnościami do obrony błon cytoplazmatycznych przed uszkodzeniami spowodowanymi stresem dehydratacji oraz niskich temperatur (-40°C i -196°C).