Rola wybranych białek w nabywaniu i ustępowaniu głębokiego spoczynku fizjologicznego nasion Acer platanoides L. i Fagus sylvatica L.
Nasiona wielu gatunków drzew leśnych klimatu umiarkowanego po osiągnięciu dojrzałości znajduje się w stanie spoczynku. U klonu zwyczajnego (Acer platanoides L., kategoria orthodox) i buka zwyczajnego (Fagus sylvatica L., kategoria intermediate) nasiona charakteryzują się głębokim spoczynkiem fizjologicznym ulokowanym w dojrzałych zarodkach. Spoczynek ustępuje w wyniku wielotygodniowego przechowywania uwodnionych nasion w temperaturze 3°C. Ustępowanie spoczynku powiązane jest z działalnością wielu szlaków metabolicznych, a blokada któregoś z procesów wiąże się z pozostaniem nasion w stanie spoczynku. Mechanizm regulujący spoczynek składa się z wielu zależnych od siebie elementów, m.in. jest wynikiem antagonistycznego działania kwasu abscysynowego (inhibitor kiełkowania) i giberelin (promotory kiełkowania). Mechanizm związany z nabywaniem i ustępowaniem spoczynku pozostaje wciąż nie w pełni zrozumiany. Niniejsza praca ma na celu przyczynienie się do lepszego zrozumienia mechanizmu regulującego spoczynek (nabywanie i ustępowanie) u nasion roślin wieloletnich charakteryzujących się głębokim spoczynkiem fizjologicznym.
Wykorzystując narzędzia biologii molekularnej: (1) proteomiki w celu poznania białek związanych z nabywaniem spoczynku, (2) immunodetekcji Western blotting w celu zanalizowania białek ABI5, 14-3-3 (białka szlaku przekazywania sygnału kwasu abscysynowego) i RGL2 (białko szlaku przekazywania sygnału kwasu giberelinowego), (3) qRT-PCR w celu analizy poziomu transkryptów genów ABI5 i 14-3-3, mikroskopię konfokalną w celu prześledzenia zmian lokalizacji badanych białek (ABI5 i RGL2), a także cytometrię przepływową dla określenia aktywności cyklu komórkowego w komórkach rozwijającego się zarodka, określono scenariusz zmian związanych z regulacją procesu spoczynku zarówno podczas jego nabywania jak i ustępowania.
W wyniku dokonanych analiz stwierdzono, że w proces morfogenezy i dojrzewania nasion klonu zaangażowane są białka związane z przetwarzaniem informacji genetycznej (białko bogate w glicynę wiążące RNA i białka proteasomu), metabolizmem metioniny (reduktaza sulfotlenku metioniny), oraz procesami komórkowymi (a-tubulina) i antyoksydacyjnymi (peroksydaza askorbinianowa). Podczas rozwoju nasion klonu zwyczajnego stwierdzono wzrost aktywności cyklu komórkowego. W 17 tygodniu po kwitnieniu zakończył się etap morfogenezy zarodka. Rozpoczął się natomiast etap dojrzewania zarodka, w którym nasiona wchodzą w stan spoczynku. Komórki zarodka w końcowej fazie dojrzewania zawierają dużą liczbę jąder z 4C DNA, co wiąże się prawdopodobnie z niezakończonym etapem dojrzewania nasion oraz z gotowością zarodka do podjęcia aktywności po ustąpieniu spoczynku. Podczas końcowej fazy dojrzewania stwierdzono akumulację białek ABI5 oraz RGL2, co wskazuje na ich udział w nabywaniu spoczynku nasion.
Ustępowanie spoczynku w wyniku chłodnej stratyfikacji powiązane jest ze zmianami w szlakach przekazywania sygnału hormonów, kwasów abscysynowego oraz giberelinowego, powodując kiełkowanie nasion. Białka ABI5 i 14-3-3 są regulowane przez chłodną stratyfikację, która obniża ich ilość i znosi działanie kwasu abscysynowego. Analiza transkrypcji (qRT-PCR) wykazała, iż poziom mRNA dla ABI5 podczas stratyfikacji zmniejsza się szybciej niż poziom białka. Białko RGL2 hamuje przekazywanie sygnału kwasu giberelinowego. Chłodna stratyfikacji obniża jego ilość umożliwiając kiełkowanie.
W kolejnych tygodniach stratyfikacji nasion stwierdzono trojakiego rodzaju zmiany w immunolokalizacji białek ABI5 i RGL2: tkankowe, komórkowe i organellowe. W trakcie stratyfikacji lokalizacja białek zmieniała się z merystemu wierzchołkowego do kory pierwotnej. Akumulacja białek ABI5 i RGL2 w merystemie wierzchołkowym w pierwszych tygodniach stratyfikacji jest związana prawdopodobnie z utrzymywaniem spoczynku. RGL2 stwierdzono w jąderkach na początku stratyfikacji, co świadczy o intensywnej aktywności transkrypcyjnej w tym okresie, związanej z utrzymywaniem spoczynku. Uzyskane wyniki wskazują na różnice w regulacji spoczynku u badanych gatunków, na co znaczący wpływ może mieć przynależność obu gatunków do dwóch kategorii, związanych z tolerancją na podsuszanie i przechowywanie, orthodox i intermediate.